聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是由各种微生物产生的作为细胞内碳和能量储备的一类可生物降解聚酯。得益于其良好的生物相容性、生物可降解性和热加工性能，PHAS已被广泛应用于生物医学材料和可降解塑料的生产。通过促进废物减少和环境可持续性，PHA为全球塑料垃圾危机提供了一个有前景的解决方案，但PHA的高生产成本和不稳定性阻碍了其商业化进程，如何优化PHA工业化生产已经成为生物材料领域的研究热点。

  PHA的生产严重依赖于碳源的选择，碳源在决定聚合物的结构和产量方面起着至关重要的作用。葡萄糖、蔗糖和淀粉被用作PHA生产的主要碳源，这些原料的高成本为大规模PHA制造带来了重大障碍。为了应对这些挑战，研究人员不断探索用于PHA生产的成本效益高的替代碳源，包括植物油、食品废料、以及农业副产品。其中，植物油尤其是棕榈油因高碳含量、低成本、质量稳定以及广泛可得性而成为有前途的选择。此外，像废弃烹饪油（WCO）这样的废油通过回收利用废弃材料成为有价值的生物聚合物，提供了更加经济的选择，从而支持环境可持续性，与循环经济原则保持一致。

  通过结合高效生产菌株和具有成本效益的原料，可以实现PHA生产成本的降低。碳源利用效率是工业生产的一个关键因素，因为它直接影响过程的经济可行性和可持续性。基因工程的改进和代谢途径优化的进展使研究人员能够提高不同碳源转化为高产量PHA的转化率。

  本研究旨在通过改造合成聚（3-羟基丁酸-共聚-3-羟基己酸）（PHBH）的C. necator H16菌株（一种C. necator H16衍生物菌株）来提升PHA工业生产。新颖之处在于结合了代谢工程用于菌株优化与假设驱动的问题解决以进行规模化生产，在生产规模上实现了生产成本的降低和环境影响的减少。值得注意的是，这个研究在使用食品级棕榈油作为碳源方面，实现了迄今为止报道的最高PHA产量。在工业规模的150立方米分批发酵中，达到264克每升的浓度，转化率达到100%，为该领域树立了新的标杆。

研究方法

这篇论文提出了通过基因工程和无偏基因组学方法优化Cupriavidus necator H16菌株，以提高其利用油基原料（包括食品级棕榈油和废烹饪油）生产PHA的能力：

• 基因编辑：通过基因编辑技术，删除了H16_A3043和H16_A3044两个基因，这两个基因编码一个双组分信号转导系统，研究发现该系统在调节应激反应和生物合成中起关键作用。
• 酶工程：在删除H16_A3043和H16_A3044的基础上，进一步通过表达外源脂肪酶基因lipAB，增强脂肪的水解能力，从而提高油料的利用效率。
• 发酵条件优化：在200 L和150 m³的大规模发酵系统中，优化了发酵条件，包括温度、pH值、搅拌速度和空气通量等，以确保高效的PHA生产。

实验设计

• Cupriavidus necator H16G、H16B及其衍生突变体进行实验。H16G菌株能够在葡萄糖上生长并产生PHB，而H16B菌株表达了异源(R)-特异性烯酰辅酶A水化酶PhaJ，能够生产含有约5% 3-羟基己烷的PHBH。

• TYGA和TYOA培养基进行菌株的培养。TYGA培养基用于初始种子培养，TYOA培养基用于第二阶段种子培养和大规模发酵。

• 10%的体积比接种到含有棕榈油或废烹饪油的发酵罐中。发酵温度控制在30°C，pH值维持在6.8，通过控制空气通量维持溶解氧浓度在20%以上。

• Tn-seq）和自适应进化筛选出高油消耗菌株。对筛选出的菌株进行基因编辑和酶工程改造，并在不同规模的发酵系统中进行评估。

结果与分析

• 碳源利用：实验表明，C. necator能够利用葡萄糖和棕榈油作为唯一的碳源进行PHA生产。棕榈油作为碳源时，PHA产量更高，成本更低。
• 突变体筛选：通过Tn-seq和自适应进化筛选出H16_A3043和H16_A3044缺失突变体，这些突变体在棕榈油消耗和PHA生产方面表现出色。
• 机制分析：代谢组学和转录组学分析表明，H16_A3043/H16_A3044系统在调节脂肪酸代谢和核苷酸生物合成中起关键作用。删除该系统显著提高了β-氧化活性，促进了PHA的生物合成。
• 规模放大：在200 L和150 m³的大规模发酵系统中，H16_A3043/lipAB菌株表现出更高的PHA产量和油消耗率。150 m³发酵系统中，最终PHA产量达到264 g/L，转化率达到100%。
• 废油利用：在200 L发酵系统中，H16_A3043/lipAB菌株使用废烹饪油作为碳源，最终PHA产量为194.3 g/L，转化率为86.2%，显示出废油作为经济可持续的碳源的潜力。

总体结论

这篇论文通过基因工程和酶工程技术，成功优化了Cupriavidus necator H16菌株，使其能够高效利用油基原料生产PHA。研究结果表明，H16_A3043/H16_A3044系统在调节脂肪酸代谢和核苷酸生物合成中起关键作用。通过规模放大实验，验证了该菌株在工业规模上的可行性和经济性。此外，废油作为碳源的利用进一步降低了生产成本和碳足迹。该研究为实现可持续、经济的PHA生产提供了新的途径，推动了全球向循环生物经济的转变。

研究关键问题

1：在研究中，选了Cupriavidus necator H16菌株作为研究对象，是基于：​​

• 广泛的碳源利用能力：Cupriavidus necator H16是一种已知的能够利用多种碳源（包括油类）进行PHA生产的菌株。这种广泛的碳源利用能力使其成为研究油基原料生产PHA的理想对象。
• 高效的PHA生产能力​​：H16菌株已被广泛用于PHA生产，并且在多个研究中表现出高效的PHA合成能力。例如，H16菌株在利用大豆油作为碳源时，能够积累高达72%-76%的PHB。
• 工业应用的潜力：由于H16菌株在PHA生产中的高效性和广泛的碳源利用能力，它已被多家领先的PHA制造商（如Bluepha、Kaneka、Danimer Scientific和Tianan Biologic）采用，显示出其在工业应用中的巨大潜力。

2：研究中通过基因工程和无偏基因组学方法优化Cupriavidus necator H16菌株以提高油基原料的利用效率主要包括：​​

• 基因编辑技术：首先，研究团队通过基因编辑技术删除了H16_A3043和H16_A3044这两个基因，这些基因编码一个双组分信号感应和转导系统。删除这些基因后，解锁了对油消费的调节限制，从而提高了PHA的生产效率。
• 过表达脂酶基因：在删除H16_A3043和H16_A3044的基础上，研究团队进一步通过过表达脂酶基因lipAB，增强了脂肪的水解能力，从而提高了油的有效利用。具体来说，过表达lipAB基因后，显著提高了发酵过程中脂肪的利用率，减少了脂肪积累和发酵过程中出现的污泥。
• 发酵条件优化：在200 L和150 m³的发酵系统中，研究团队优化了温度、pH值、搅拌速度和空气通量等条件，以确保高效的PHA生产。这些优化措施进一步提高了菌株的油消耗和PHA产量。

3：在大规模发酵过程中，ΔA3043/lipAB菌株的优势主要在于：​​

• 更高的油消耗和PHA产量：在150 m³的发酵系统中，ΔA3043/lipAB菌株表现出更高的油消耗、生物量和PHA产量。具体来说，该菌株在60小时的分批发酵中实现了264 g/L的最终PHA产量，比原始菌株H16B提高了25.4%。
• 碳足迹减少：通过优化发酵条件和过表达脂酶基因，ΔA3043/lipAB菌株在生产过程中减少了29.7%的碳足迹。特别是，使用废烹饪油代替棕榈油后，碳足迹进一步减少了39.0%，总减少量达到52.7%。这表明ΔA3043/lipAB菌株不仅提高了生产效率，还有效降低了生产过程中的环境影响。

解决污泥形成问题：过表达脂酶基因lipAB后，解决了发酵过程中出现的污泥问题，显著提高了发酵效率和PHA产量。这一改进不仅提高了生产效率，还有助于减少后续处理过程中的能耗和废物产生。

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英文原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2025.04.001

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