随着基于液相色谱-质谱（LC-MS）的代谢组学应用和非靶向代谢研究的日益增多，对具有广泛极性的大量分子的可

靠色谱分离方法的需求也在增加。

亲水相互作用液相色谱（HILIC）是一种新兴的与质谱兼容的分离技术，它通过多种保留机制保留极性化合物。与反

相液相色谱（LC）相比，它的逆保留特性在分离极性代谢物方面提供了优势。然而，选择合适的HILIC固定相和移动

相系统作为代谢组学研究中成功的工具并非易事。

在本应用中，我们使用了一种1.8-μm iHILIC-Fusion UHPLC HILIC色谱柱，填充有电荷调节的羟乙酰胺基硅胶。其分

离原理结合了亲水分配、弱静电相互作用和氢键。

研究方法

这个应用提出了使用HILIC-UHPLC-MS方法进行代谢组学研究，具体来说，

色谱柱选择：使用了1.8-μm iHILIC-Fusion UHPLC HILIC柱，填充有电荷调制羟基乙基酰胺硅胶。
梯度洗脱：使用以下梯度洗脱程序：
- A) 乙腈/甲醇（98/2，v/v）
- B) 10 mM 氨基甲酸铵与0.1%（v/v）甲酸的超高纯（Milli-Q）水中（pH 3.15）
MS系统设置：使用Agilent 1290 Infinity UHPLC系统和Agilent 6530 QTOF质谱仪。干燥气温度为250℃，流速为8 L/min；鞘气温度为350℃，流速为11 L/min；雾化器压力为45 psig；毛细管电压为2000 V；碎片器电压为150 V。
样品制备：标准溶液以1μg/mL的浓度在60/40（v/v）乙腈/Milli-Q水中制备，用于估计保留时间。选择的代谢物的物理化学范围足够广泛，以保证可靠的（非脂质）代谢组学分离。

实验设计

细胞培养：使用HepaRG细胞在12孔板上进行细胞培养。
液液萃取：每孔用80%甲醇水溶液刮取细胞，然后使用1/1.5/1甲醇/水/氯仿混合物进行液液萃取。收集极性相并蒸发至干，然后以60/40（v/v）乙腈/Milli-Q水复溶。
色谱分离：使用上述HILIC-UHPLC-MS系统进行色谱分离，记录色谱图。

标准品色谱分离：11种标准品的归一化色谱图显示，保留时间随化合物极性增加而增加。值得注意的是，亮氨酸和异亮氨酸（5和6）之间的分离效果显著，因为它们仅在烷烃链上的甲基位置不同，这在其他HILIC柱中通常难以分离。

图1标准品的HILIC-MS色谱分离结果：1）孕酮，2）咖啡因，3）腺嘌呤，4）苯丙氨酸，5）亮氨酸，6）异亮氨酸
，7）丝氨酸，8）酪氨酸，9）叶酸，10）赖氨酸，11）鸟氨酸
细胞提取物色谱分离：注入标准品的色谱图证实了细胞提取物的分离效果。相对非极性化合物首先被洗脱；中性极性化合物在3到10分钟之间洗脱；极性碱性化合物在10到15分钟之间洗脱。总之，新开发的方法可以在15分钟的梯度运行中检测到700种分子。
质量控制：通过重复注入QC样本，评估了色谱图的质量。计算了每个化合物的相对标准偏差（RSD），并评估了整个数据集的RSD。结果显示，iHILIC-Fusion的mRSD为6.7%，70%的变量的RSD低于15%。根据FDA的规定，RSD低于20%被认为是可接受的。因此，当前的HILIC-UHPLC-MS设置提供了一个出色的检测系统，适用于代谢组学研究中极性化合物的分析。
图3提取特征的代谢组学偏差