研究问题

糖基化分为N-连接与O-连接两种类型，如何在蛋白质的特定位点识别N-和O-糖基化，并获取糖链的结构信息。其位点异质性与结构复杂性使得糖肽鉴定极具挑战。尽管质谱技术已成为糖蛋白分析的主流手段，但仍需专门的样品前处理与生物信息学工具支持。

研究难点

研究的难点包括：糖基化的异质性、糖肽的解离行为改变以及需要特定的样品制备、质谱和数据分析方法。

相关工作

研究相关工作包括使用高级串联质谱进行糖蛋白组学分析，并结合强大的数据挖掘算法来表征蛋白质糖基化。使用已有的工具GlycReSoft已被广泛应用于糖蛋白的分析。

文章提出了一套用于糖蛋白质组学分析的方法，结合了高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）技术和生物信息学方法。具体包括：

1. 样品制备

首先是从纯化的糖蛋白、细胞或者组织中提取糖蛋白样品的详细步骤，包括使用还原、烷基化、脱盐处理，以及酶切反应消化。

2. 糖肽富集

对于细胞或组织中的糖蛋白，使用亲水相互作用色谱（HILIC）方法进行糖肽富集。该方法使用两性离子型亲水作用(ZIC-HILIC)固相萃取小柱 iSPE HILIC进行高效的糖肽分离。

3. LC-MS数据采集：使用Thermo Scientific Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪和nano-LC-MS系统进行高分辨率的糖肽、肽段消化物分析。具体的质谱参数包括：

色谱柱：Acclaim PepMap®nano-LC柱

流动相：0.1%甲酸水溶液（溶剂A）和80%乙腈和0.1%甲酸水溶液（溶剂B）

质谱仪设置：数据依赖采集模式，自动增益控制（AGC）目标值为5 X 10^5。前体离子扫描分辨率为120,000，选择强烈的先导离子进行后续碎片化。

4. 数据分析 ：使用GlycReSoft软件进行数据处理和分析。具体步骤包括：

• 将LC-MS原始数据预处理，进行去同位素和电荷状态解卷积。

• 构建糖链和糖肽假设，使用GlycReSoft的“Build Search Space”窗口进行定制。

• 分析样本并查看搜索结果，使用“Search Glycopeptide Sequences”选项进行糖肽序列搜索，并使用“View Results”窗口查看结果。

  

 图1 使用GlycReSoft的糖肽分析工作流程

这篇文献描述了一套完整的糖蛋白组学分析方案，结合了LC-MS技术和生物信息学方法，成功实现了

糖蛋白的糖基化和位点占据的识别与分析。该方法不仅适用于纯化的糖蛋白，也适用于细胞、组织中的糖蛋白分析，为理解糖蛋白在生理和病理过程中的作用提供了重要的技术支持。文章提供了从样品制备到数据分析的标准化流程，结合了多种碎裂技术与富集策略，提升鉴定覆盖度，采用开源可用的GlycReSoft 软件，支持自定义数据库。

• 糖肽富集：ZIC-HILIC 方法

  由于糖肽在总肽段中占比低，富集步骤必不可少。本文推荐使用Zwitterionic-HILIC 材料进行糖肽富集，其优势在于：   

  — 对酸性、中性与碱性糖链均具有良好亲和力 — 适用于复杂样本，比如细胞、组织

  — 操作流程标准化，重现性高

• 多碎裂技术联用：HCD + CID + ETD

  — HCD：提供高质量精度的糖链与肽段碎片信息

  — CID：擅长糖链断裂，适合糖链结构解析

  — ETD：保留糖链，优先断裂肽段骨架，特别适用于O-糖位点定位

• GlycReSoft：糖肽数据分析利器

  — 支持mzML/mzXML格式输入

  — 可自定义糖链与蛋白质数据库

  — 自动完成糖肽鉴定、位点定位、相对定量

  — 图形化界面，支持结果可视化与导出

文章标题：Glycoproteomics Sample Processing, LC-MS, and Data Analysis Using GlycReSoft

原文链接： Curr Protoc. 2021 Mar;1(3):e84.doi:10.1002/cpz1.84.

原文下载：Glycoproteomics Sample Processing, LC-MS, and Data Analysis Using GlycReSoft

中文翻译：糖蛋白组学样本处理、LC-MS及使用GlycReSoft进行的数据分析