基因毒性杂质

基因毒性杂质（genotoxic impurities，GTI）又称遗传毒性杂质，由于杂质的遗传毒性主要通过沙门氏菌回复突变实验（Ames实验）界定，所以也称为致突变性杂质。基因毒性杂质一般是亲电试剂（Electrophiles），它能够与遗传物质发生反应，直接或间接地损伤细胞DNA（包括:DNA烷基化、染色体断裂、DNA重组及复制过程中共价键的插入和修饰等），产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。基因毒性杂质与其它药物杂质相比，即使在很微量的情况下，对服药者（尤其长期服药者）也具有严重的危害性。研究基因毒性杂质的根本目的是控制和降低其在人体中可能引发癌症的风险。

N-亚硝胺类基因毒性杂质

2018年7月华海药业在缬沙坦原料药中检测出微量的毒性杂质V- 亚硝基二甲胺(NDMA), 随后该企业主动报告给欧洲药品管理局(EMA)以及美国食品药品监督管理局 (FDA),并触发了欧盟审查2018年7月国家药品监督管理局(NMPA)与该企业分别就缬沙坦原料药事件进行公告说明，相关原料药在国内外均进行了召回四。自此，N-亚硝胺类基因毒性杂质在药学界受到广泛关注。

亚硝胺杂质重要事件时间轴

在以上事件中所涉及的基因毒性杂质均属于N-亚硝胺类化合物，其结构通式为R₂(R₁)N-N=0(表1),当R1与 R₂相同时，称为对称性亚硝胺，如NDMA和 NDEA;当R₁与R₂不同时，称为非对称性亚硝胺，如NEIPA等。造成药物中亚硝胺污染的原因主要有：(1)在药物合成过程中发生副反应，生成具有基因毒性的N- 亚硝胺类杂质，例如：仲胺、叔胺、季铵盐类化合物与亚硝酸等亚硝化试剂相互作用；溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的氧化；橡胶硫化剂与空气中氮氧化合物相互作用等。(2)药物在储存或者运输过程中发生氧化或还原等反应，最终生成具有基因毒性的N-亚硝胺类杂质，例如：雷尼替丁由于结构中存在一个不稳定的二甲氨基，在储存过程中会发生降解产生NDMA。N-亚硝胺类对人体产生基因毒性需要先经过细胞色素 P450酶催化代谢后才能和 DNA发生作用，产生基因毒性，作用机理主要有以下两点：①代谢得到活性烷基和大分子(DNA 或者蛋白质)烷基化是产生遗传毒性和致癌性的主要原因；②代谢得到的小分子醛会进一步和DNA结合造成额外的损伤。

N-亚硝胺类杂质 TD50数值与合理限度的制定问题

自“亚硝胺类事件”出现之后，从长远角度考虑，各研发机构均需采取有效的措施及制定合理的控制策略，以避免工艺中产生亚硝胺类杂质。各国监管部门对于亚硝胺类基因毒性杂质的控制策略有所不同，FDA 和 EMA 在事件初期发布了亚硝胺类杂质临时限度（Interim Limits)。随后，EMA要求在2年内对所有药物进行亚硝胺风险评；FDA要求在其2020年9月发布《人用药物中亚硝胺杂质控制》（Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs）指南后6个月内，对已批准和上市的药物进行亚硝胺风险评估；NMPA 发布了《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）。随着对亚硝胺类杂质认知的不断深入，监管部门接受在对亚硝胺类化合物进行充分风险评估的基础上，对致癌性研究数据充分的亚硝胺类化合物，可以采用TD50进行线性外推得到其（终身）可接受摄入限度（acceptable intake limits），如 NDMA（AI=96 ng/d）和 NDEA（AI = 26.5 ng/d）的可接受摄入量限度是根据其TD50推算的（表2）。而对于致癌性研究不充分的亚硝胺类化合物 [ 如 N- 亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）和N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）]，即使其有 TD50值也不能直接采用，仍需要通过构效关系（SAR）分析制定合理限度；如 NMBA 的可接受摄入量可以根据 NDMA的TD50进行推算，NDBA和NDIPA 的可接受摄入量可以根据NDEA的TD50进行推算。对于致癌性数据未知的亚硝胺类化合物，EMA 推荐采用安全工作组（safety working party，SWP）的特定类别化合物的TTC18ng/d作为保守限度；而对于结构类似的亚硝胺类化合物，也可以通过SAR分析制定合理限度，如N-亚硝基乙基异丙胺（NEIPA）的可接受摄入量可以根据NDEA的TD50进行推算。

表 2 N- 亚硝胺类杂质的终身可接受摄入限度

亚硝胺类杂质分析方法

N-亚硝胺类化合物广泛存在于烟熏、腌渍食品，个人护理品、化妆品以及污水中，所以在这些方面的研究较为成熟，而关于药品中N-亚硝胺类化合物的研究则进展缓慢120。自2018年“缬沙坦事件”之后，各国药品监督管理部门开始重视 N-亚硝胺类基因毒性杂质。目前FDA、EDQM 以及NMPA都发布了N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测方法(见表4)。由于这类杂质在药物中一般以痕量形式存在，对分离检测技术提出了挑战，目前文献中报道的常用的分离方法主要有气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)等；检测方法以质谱法(MS)为主，如四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪(Q-TOF),除此之外，还有热能分析仪(TEA) 、紫外检测器(UV)等。

表3部分监管机构发布的检测方法
监管机构	分析方法	提取溶剂	检测亚硝胺种类
NMPA	GC-MS	甲醇(MeOH)	NDMA NDEA
	HS-GC-MS	N-甲基吡咯烷酮 (NMP)	NDMA NDEA
EDQM	LC-MSMS	MeOH	NDMANDEA
	LC-(APCI)MSMS	水(H₂O)	NMBA
	HS-GC-MS	(二甲基亚砜)DMSO	NDMA NDEA
			NEIPA NDIPA
FDA	GC-MSMS	(二氯甲烷)DCM	NDMA NDEA NEIPA NDIPA
			NDBA
	LC-HRMS	MeOH	NDMA NDEA
			NEIPA NDIPA
			NDBANMBA

新挑战及未来趋势

目前，制药行业和监管部门对基因毒性杂质还在不断的认知。这一点在FDA发布的相应公告中也有指出.其具体表现为亚硝胺类杂质在其他类型药物中不断被发现，在理论上，所有药物都存在N-亚硝胺类杂质或被N-亚硝胺类杂质污染的风险，因此建立便捷、高效的分析方法是非常有必要的。但目前仍然存在一些挑战：药物基质与N-亚硝胺类化合物如何高效地分离；分离之后如何富集等等，均是有待研究的。基因毒性杂质的风险评估、排查与控制，是一项跨部门、跨学科且具有相当挑战性的工作（图1）。随着我们对基因毒性杂质研究的不断深入，我们对其了解也将不断加深。监管部门对于基因毒性杂质限度的合理制定，也有着一个发展的过程。如在亚硝胺类杂质残留事件的最初发生阶段，FDA的立场是亚硝胺类杂质不得存在（Should be absent）；在这种情形下，亚硝胺的实际控制限度由相应检测方法的最低检测限（LOD）所决定。对于NDMA和NDEA，FDA 发布方法的LOD分别为5和1 ppb（相对于缬沙坦的每日最大剂量而言）。随着事件的发生和发展，对于这2个亚硝胺类杂质，FDA 现在接受由相应TD50 推算的 AI，分别为 NDMA 96 ng/d 和 NDEA 26.5 ng/d（相当于在缬沙坦中的含量分别为 300 和 82.8 ppb）。另外，制定可接受限度（尤其是临时可接受限度）的一个重要考量是如果受到影响的药物召回，是否会造成这类药物的短缺，以及短缺所造成的后果是否会更严重。笔者认为目前毒理学评估，尤其是对于Ames阴性的亚硝胺类杂质，如何充分地评估、制定合理的限度仍不明朗；未来基因毒性杂质的风险评估、排查与控制将是原料药工艺开发的重中之重；基因毒性杂质分析方法的开发过程中，如何解决灵敏度、选择性、假阳性和假阴性问题也将是持续的挑战。

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基因毒性杂质研究白皮书 2（2025）

基因毒性杂质的挑战与控制策略——从ICH指导纲领到实际操作层面

原料药中基因毒性杂质分类清除及控制策略

N-亚硝胺类基因毒性杂质的研究进展

N-亚硝胺杂质备忘录

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N-亚硝胺类基因毒性杂质主要来源于药物合成过程中发生的副反应，以及药物在储存运输过程中发生的氧化或还原等反应，目前官方的分析方法中GC/LC-MS相关的检测方法占绝大多数，选择高纯度、稳定的分析标准品是保证分析结果准确的重要一环